當(dāng)下微生物研究存在兩個(gè)趨勢，一是隨著大量腸道微生物相關(guān)研究的開展，研究者們越來越認(rèn)識(shí)到腸道微生物尤其是大量厭氧菌與人類健康息息相關(guān)，因?yàn)槟c道本身在某種程度上也屬于厭氧環(huán)境，故對腸道細(xì)菌的細(xì)胞生理學(xué)研究需要建立在厭氧培養(yǎng)環(huán)境的基礎(chǔ)之上；二是僅依靠經(jīng)典的微生物群體培養(yǎng)方法已經(jīng)難以滿足對細(xì)胞異質(zhì)性的研究，需要發(fā)展多種方法在單細(xì)胞水平進(jìn)行細(xì)菌生理學(xué)研究，以此深入研究被細(xì)胞群體所掩蓋而被研究者忽略的生理規(guī)律。該研究開發(fā)了一種微生物在厭氧條件下的培養(yǎng)方法，包括相關(guān)培養(yǎng)裝置設(shè)計(jì)與相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法流程，在穩(wěn)定維持培養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格厭氧程度的基礎(chǔ)上，使用微流控芯片對細(xì)菌進(jìn)行長時(shí)間的單細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)結(jié)合高分辨率顯微鏡延時(shí)成像技術(shù)，在培養(yǎng)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對生長動(dòng)態(tài)的實(shí)時(shí)觀測與數(shù)據(jù)采集。該方法為細(xì)菌細(xì)胞在厭氧條件下的單細(xì)胞分析提供了有力的技術(shù)支持。

 近年來，得益于 DNA 測序技術(shù)的不斷迭代優(yōu)化，微生物組研究取得了蓬勃發(fā)展。微生物培養(yǎng)方法是微生物相關(guān)研究的絕對基礎(chǔ)，是不可繞開的關(guān)鍵一環(huán)。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法包括選擇培養(yǎng)法、平板單克隆培養(yǎng)法、基于密度/細(xì)胞尺寸篩選法和有限稀釋法等，均為微生物實(shí)驗(yàn)室的常用基礎(chǔ)方法。微生物學(xué)家通過各種培養(yǎng)方法能夠獲得特定細(xì)胞株系的純培養(yǎng)，進(jìn)而為各種細(xì)胞生理學(xué)實(shí)驗(yàn)提供準(zhǔn)確而充足的研究對象。但由于某些微生物相關(guān)培養(yǎng)方法的缺失，大大阻礙了研究者對其一些基本屬性的認(rèn)知，進(jìn)而影響到相關(guān)生態(tài)以及生物學(xué)現(xiàn)象的研究。

傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法所得到的純培養(yǎng)物，理論上應(yīng)是來源于同一菌株，幾乎不存在明顯的遺傳變異，通過對其進(jìn)行測量能夠獲得許多生理學(xué)參數(shù)，包括生長速率、死亡率、細(xì)胞尺寸分布和基因表達(dá)強(qiáng)度等，也能夠獲得類似Monod 方程這樣對工業(yè)生產(chǎn)有著一定指導(dǎo)意義的經(jīng)驗(yàn)公式。而隨著對細(xì)胞生理狀態(tài)噪聲與隨機(jī)波動(dòng)相關(guān)研究的逐漸深入，研究者們越來越意識(shí)到細(xì)胞異質(zhì)性的存在與重要性，即從某種角度來講每個(gè)單細(xì)胞都可能與其他細(xì)胞有所區(qū)別。若要對細(xì)菌進(jìn)行單細(xì)胞水平的培養(yǎng)與研究，則傳統(tǒng)的群體培養(yǎng)方法已不能滿足要求，需要開發(fā)新的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)技術(shù)。

在細(xì)菌單細(xì)胞水平進(jìn)行生理學(xué)研究的重要技術(shù)手段之一是利用基于微流控技術(shù)的高分辨顯微鏡延時(shí)拍攝方法。其中，微流控技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞培養(yǎng)，并且有著高度的可設(shè)計(jì)性和對實(shí)驗(yàn)條件的可控性；而顯微鏡延時(shí)拍攝方法則是在不影響細(xì)胞生理活動(dòng)的前提下，實(shí)時(shí)采集各種參數(shù)，與“下一代細(xì)菌生理學(xué)技術(shù)”的理念高度符合。目前相關(guān)技術(shù)的報(bào)道仍主要集中于常規(guī)件的有氧培養(yǎng)，對于與人類健康息息相關(guān)的大量厭氧菌與兼性厭氧菌的厭氧生理學(xué)的研究則相對較少。該技術(shù)的主要難點(diǎn)在于既要確保培養(yǎng)裝置的氣密性，又要將整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)(包括微流控裝置、氣體控制裝置等)與相關(guān)商業(yè)化顯微鏡進(jìn)行適配。此外，由于厭氧條件下細(xì)菌生長相對較慢，需要確保整個(gè)系統(tǒng)能夠長期穩(wěn)定的運(yùn)行。

本研究提供了一種厭氧微生物培養(yǎng)與實(shí)時(shí)觀測裝置。該裝置包括：底座、上蓋、微流控芯片和培養(yǎng)液儲(chǔ)存室。其中，培養(yǎng)裝置上蓋水平面上設(shè)有亞克力板或玻璃板視窗，與微流控芯片底部蓋玻片相對設(shè)置，便于顯微成像；培養(yǎng)基儲(chǔ)液池上設(shè)有出液孔，可與微流控芯片相連為細(xì)胞培養(yǎng)提供充足的營養(yǎng)；培養(yǎng)裝置上蓋的側(cè)壁上設(shè)有氣體入口、氣體出口和出液口，以便維持培養(yǎng)裝置內(nèi)的厭氧氛圍、氣壓穩(wěn)定以及液體的流通。該裝置具有優(yōu)異的氣密性，能夠?yàn)閰捬跷⑸锾峁╅L時(shí)間穩(wěn)定的厭氧氣體氛圍且氣體氛圍可控；同時(shí)可以滿足高通量、大范圍多位點(diǎn)采樣，高放大倍數(shù)拍攝等實(shí)驗(yàn)需求。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 微流控芯片的設(shè)計(jì)

 本實(shí)驗(yàn)所使用的微流控芯片被稱為母細(xì)胞芯片(Mother Machine)于將細(xì)菌許多單個(gè)母細(xì)胞(Mother Cell)保持在固定位置持續(xù)生長，具體設(shè)計(jì)如圖 1 所示。其中，圖 1(a)中單細(xì)胞生長通道總數(shù) 4 000，寬度為 0.8～2.6 μm (以 0.2 μm 的梯度增加)，高度為 1.2 μm，長度為 25 μm；培養(yǎng)基通道寬度為100 μm，高度為 100 μm，箭頭表示其中液體培養(yǎng)基流動(dòng)。采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作的芯片整體封接在蓋玻片(尺寸 24 mm×50 mm)上，具體內(nèi)部結(jié)構(gòu)處于 PDMS 與蓋玻片之間：細(xì)菌細(xì)胞單層生長于較窄、較低的眾多生長通道內(nèi)，這些單細(xì)胞生長通道一端為封閉端，另一端開口與更寬、更高的培養(yǎng)基通道相接，培養(yǎng)基通道兩側(cè)開頭通過持續(xù)不斷的液體培養(yǎng)基流動(dòng)，以及營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散作用，為單細(xì)胞生長通道內(nèi)的細(xì)胞提供源源不斷的營養(yǎng)成分。在營養(yǎng)充分的條件下，通道內(nèi)的細(xì)菌細(xì)胞隨著時(shí)間推移逐漸沿著生長通道分裂生長為一條線，多余細(xì)胞通過分裂生長自然伸出生長通道，被培養(yǎng)基通道內(nèi)的高速液體流動(dòng)沖走。此時(shí)，處于生長通道封閉段的母細(xì)胞在微流控芯片內(nèi)的相對位置不變，其營養(yǎng)條件也是穩(wěn)定的，因而整個(gè)微流控芯片設(shè)計(jì)可被看作一種單細(xì)胞水平的微量培養(yǎng)恒化器。

                                                                                                                        (a) 示意圖                                                                                                                   (b) 實(shí)物圖

圖 1 母細(xì)胞芯片微流控芯片圖

2.2.2 硅片模板

 (1)單細(xì)胞生長通道的制作

 a. 準(zhǔn)備 76.2 mm 的硅片，用低強(qiáng)度等離子處理 30 min。

 b. 從冰箱中取出 SU-8 2002 光刻膠和 SU-8 2000.5 光刻膠，待光刻膠溫度與室溫一致時(shí)，按V(SU-8 2002)∶V(SU-8 2000.5)＝8∶2(體積比)將兩種膠在離心管中混勻。

 c. 設(shè)定勻膠機(jī)程序：預(yù)甩 600 r/min，9 s；勻膠 4 000 r/min，30 s。

 d. 將表面潔凈的硅片置于勻膠機(jī)吸盤上，在硅片上添加室溫混合膠 2 mL，運(yùn)行程序。

 e. 將硅片置于平整的熱板上 95 ℃ 烘 2 min。

 f. 在曝光機(jī)的吸盤周圍套入橡膠圈，將第一層鉻板掩膜清潔干凈后放在臺(tái)架上(鍍鉻面向下)，并開啟真空，將一塊較大的錫箔紙蓋在掩膜上。

 g. 將硅片放在吸盤上，待冷卻后推入(記錄此時(shí)硅片的位置，確保在后續(xù)可以對準(zhǔn)結(jié)構(gòu))。

 h. 上升吸盤，用錫箔紙遮蓋，執(zhí)行真空曝光，觀察真空表讀數(shù)——如果漏氣，則復(fù)位吸盤后再次上升，確保橡膠圈與掩膜貼合良好不漏氣。

 i. 曝光量為 70 mJ/cm2，需要根據(jù)曝光機(jī)的功率調(diào)整曝光時(shí)間。其中，預(yù)設(shè)曝光時(shí)間應(yīng)長于真實(shí)曝光時(shí)間(如需曝光 4 s，則設(shè)置 30 s 曝光時(shí)間)。啟動(dòng)曝光時(shí)先用錫箔紙遮擋，當(dāng)剩余時(shí)間等于需曝光時(shí)間時(shí)，快速撤下錫箔紙，結(jié)束曝光。

 j. 曝光后于 95 ℃ 烘 1 min，取下硅片，冷卻。

 k. 用丙二醇甲醚醋酸酯(PM)顯影液顯影；隨后用異丙醇沖洗殘留顯影液，接著用氮?dú)獯蹈杀砻妫隗w視顯微鏡下觀察顯影效果。

 l. 若顯影后結(jié)構(gòu)清晰，則用烘箱 180 ℃ 堅(jiān)膜1 h，否則重復(fù)上一步。

 m. 冷卻后取出，用臺(tái)階儀測量子通道高度并記錄。

(2)培養(yǎng)基通道的制作

 整體實(shí)驗(yàn)流程與上部分單細(xì)胞生長通道的制作相同，但需要修改一些具體的實(shí)驗(yàn)參數(shù)：使用SU-8 3025 光刻膠，離心 3 000 r/min，前烘30 min，需要進(jìn)行校準(zhǔn)使其與第一層對齊，曝光量為 150 mJ/cm2，后烘 5 min。

2.2.3 PDMS 芯片制作

 (1)固定硅片模板

 a. 將硅片模板用透明膠貼在玻璃板中間(勿貼到結(jié)構(gòu))，同時(shí)在玻璃板四周豎著貼上錫箔膠帶密封，防止倒入 PDMS 單體后在熱固化時(shí)泄漏；

 b. 將 PDMS 單體和引發(fā)劑以 10∶1 的質(zhì)量比混合，攪拌(5 min)均勻，然后抽真空 15 min，再用洗耳球吹除表面剩余氣泡；

 c. 將上一步無氣泡 PDMS 與引發(fā)劑的混合液體，適量倒入第(a)步制作好的貼有硅片模板的玻璃板容器內(nèi)，放入烘箱內(nèi)的水平臺(tái)上，80 ℃、烘 30 min 以上。

也可以直接用無塵膠帶將模板貼到玻璃板容器中間后，直接倒入 PDMS 和引發(fā)劑進(jìn)行 PDMS 芯片固化。

 (2)PDMS 芯片固化

 a. 將 PDMS 單體和引發(fā)劑以 10∶1 的質(zhì)量比混合，攪拌(5 min)均勻后抽真空(10 min)，最后用洗耳球吹除表面剩余氣泡；

 b. 根據(jù)硅片模板表面積及所需微流控芯片厚度計(jì)算 PDMS 和引發(fā)劑混合液體用量(這里芯片厚度約為 5 mm，PDMS 和引發(fā)劑混合液體需22 g 左右)，倒在硅片模板上，整體放入烘箱，80 ℃ 烘 1 h 以上。

(3)PDMS 芯片切割

使用手術(shù)刀將固化好的芯片從硅片模板上切下，注意不要太靠近芯片結(jié)構(gòu)，刀落到硅片上，切到底可見空氣進(jìn)入的痕跡，然后將芯片放在LED 燈上進(jìn)一步切割。

(4)PDMS 芯片打孔

將 PDMS 芯片放在 LED 燈上操作，選擇合適孔徑(這里為 0.8 μm)的打孔器從結(jié)構(gòu)面向下打，拔出時(shí)要小心緩慢，可雙向旋轉(zhuǎn)拔出，注意不要裂口，然后用氮?dú)鈿饬髑謇泶蚝玫目?注意打孔器的針頭最好頻繁更換，以避免打孔時(shí)產(chǎn)生過多的 PDMS 碎屑對單細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生堵塞通道，可在正式打孔前測試一下)。

(5)PDMS 芯片與蓋玻片封接

 a. 先用異丙醇清洗蓋玻片，然后氮?dú)獯党惐家后w；

 b. 用無塵膠帶粘去 PDMS 芯片結(jié)構(gòu)面灰塵及碎屑；

 c. 將蓋玻片和 PDMS 芯片結(jié)構(gòu)面向上放置，一起進(jìn)行等離子清洗——HI 檔(18 W，氣壓266 Pa，氣流 25 mL/h)，2 min(等離子處理時(shí)間可調(diào)整，一般不要超過 2 min)；

 d. PDMS 芯片依靠重力貼在玻璃板上(多塊芯片考慮排布以合理利用空間)，若貼合過程迅速則表明等離子處理后 PDMS 芯片和蓋玻片表面性質(zhì)良好；

 e. 貼合后的芯片放入烘箱 80 ℃ 烘 10 min。

 (6)通道修飾及鏡檢

 a. 將已過濾除菌的 1% F-127 水溶液，通過培養(yǎng)基通道入口緩慢注入芯片(戴護(hù)目鏡)，修飾至少 30 min；

 b. 10 倍鏡或 20 倍鏡下檢查芯片通道(是否完好)、打孔及封接情況，無誤后放入?yún)捬豕ぷ髡尽?/span>

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