大家好！為大家介紹一篇 2020 年發(fā)表在PNAS的文章，題目為 “A rapid and label-free platform for virus capture and identification from clinical samples” 。文章由The Pennsylvania State University的Mauricio Terrones課題組和New York University的Elodie Ghedin課題組合作完成。文章介紹了一種含有碳納米管陣列的微流控芯片，根據(jù)尺寸的物理參數(shù)，在3分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣品中病毒分離，并對(duì)其進(jìn)行快速分析、鑒定，準(zhǔn)確率可以達(dá)到90%。該平臺(tái)不僅可以進(jìn)行快速病毒樣本分析，富集后的病毒樣品還可以回收并進(jìn)行下游分析。Mauricio Terrones課題組的研究方向是多維度碳納米材料的開發(fā)應(yīng)用，及納米器件的設(shè)計(jì)開發(fā)，課題組網(wǎng)頁是https://sites.psu.edu/terronesresearch/；Elodie Ghedin課題組的研究方向是利用基因組學(xué)、分子病毒學(xué)和計(jì)算生物學(xué)的工具定義人類寄生蟲和其他病原體的基因組特征，課題組網(wǎng)頁是https://wp.nyu.edu/ghedinlab/。

[背景]

病毒種類多樣且進(jìn)化速度迅速，目前有上百萬種未知病毒具有潛在的傳染人類的風(fēng)險(xiǎn)。因此迅速查找并確認(rèn)病毒種類成為控制傳染病以及傳染病學(xué)中重要的一環(huán)。在傳播的早期，發(fā)現(xiàn)和純化相應(yīng)病毒是控制傳染的第一步。現(xiàn)有技術(shù)的突破主要是通過新一代的快速測序技術(shù)等基因工具來對(duì)分離或者培養(yǎng)后的病毒進(jìn)行檢測，用以確定病毒種類。然而漫長的培養(yǎng)不僅引入病毒變異的可能，也浪費(fèi)了寶貴的時(shí)間，對(duì)于病毒進(jìn)行快速有效的監(jiān)控具有一定挑戰(zhàn)性。

[VIRRION 平臺(tái)]

作者開發(fā)了一套完整的高通量樣本制備平臺(tái)，結(jié)合碳納米材料、微流控芯片及快速拉曼光譜儀，用于快速進(jìn)行多種病毒的富集和無標(biāo)簽化檢測。該平臺(tái)命名為VIRRION（virus capture with rapid Raman spectroscopy detection and identification）。相比于之前他們的工作中1 mL/h的通量（見引用鏈接），VIRRION體系具有更高的通量，以滿足臨床樣本的需求。

圖1 VIRRION平臺(tái)內(nèi)部具有精準(zhǔn)可控的碳納米管陣列結(jié)構(gòu)，用于通過尺寸捕獲樣品中的病毒。毫米級(jí)的芯片通道可以保證在處理樣品時(shí)具有足夠的通量

        VIRRION平臺(tái)的設(shè)計(jì)采用微米、納米兩個(gè)尺度上的富集方法。首先，利用魚骨型陣列構(gòu)建微米尺度的湍流系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)微通道內(nèi)高效的液體混合效率；其次，以可控的氮摻雜碳納米管陣列參雜金納米粒子實(shí)現(xiàn)魚骨型通道的組裝，在病毒尺度上實(shí)現(xiàn)不同病毒顆粒的富集及無標(biāo)記拉曼檢測（摻雜金納米粒子，以增強(qiáng)拉曼信號(hào)）；利用鐵催化劑對(duì)碳納米管生長過程的影響，實(shí)現(xiàn)不同間隙的碳納米管的組裝（間隙尺寸從22 ± 5 到 720 ± 64 nm可控）。

圖 2 壓印的方法制作VIRRION及不同內(nèi)部間隙的碳納米管陣列

[結(jié)果驗(yàn)證]  

1、捕獲驗(yàn)證作者首先使用不同尺寸的熒光納米粒子驗(yàn)證平臺(tái)對(duì)納米粒子的捕獲效率。在設(shè)置的三個(gè)捕獲區(qū)域內(nèi)，作者分別對(duì)400，140，25 nm的微粒進(jìn)行捕獲。在500 uL/min的流速下，可以達(dá)到34.3 ± 4.5 %的捕獲效率。而在模擬手推注射器4 mL/min的流速下，該平臺(tái)依舊有22 %的捕獲效率。由于樣品排出后可以回收，將回收樣品再次注入平臺(tái)內(nèi)，可以使得回收效率進(jìn)一步提高。在經(jīng)過四次重新注入的情況下，納米粒子的捕獲效率可以達(dá)到40%。這些表明了該平臺(tái)在不同流速下，對(duì)不同尺寸的納米粒子可以很好的進(jìn)行分離和捕獲。

圖3 不同納米熒光粒子在芯片內(nèi)被捕獲。納米粒子按照其尺寸，在相對(duì)應(yīng)的區(qū)域所捕獲，從而達(dá)到分離不同尺寸納米粒子的作用

2、鑒定平臺(tái)及活性分析

作者為了驗(yàn)證該平臺(tái)對(duì)病毒的鑒定能力，使用3種病毒建立了拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，每種病毒采樣100個(gè)點(diǎn)作為指紋庫。每種病毒在10²/mL的濃度下可以實(shí)現(xiàn)很好的區(qū)分。10²/mL的檢測靈敏度，接近RT-PCR。作者結(jié)合主成分分析方法（principal-component analysis, PCA)及交叉學(xué)習(xí)的機(jī)器算法實(shí)現(xiàn)了病毒的聚類分析，準(zhǔn)確度達(dá)到72%。作者通過對(duì)兩種禽流感病毒在富集前后的測序分析，結(jié)果顯示VIRRION平臺(tái)可以完整的保留病毒的基因組學(xué)信息。并且，通過富集，大大提高到了數(shù)據(jù)中病毒的含量，降低了宿主信息，進(jìn)一步提高病毒鑒定的分辨率。

圖4  三種病毒建立拉曼數(shù)據(jù)庫及病毒聚類分析

3、臨床樣本分析

作者使用臨床中的鼻拭子進(jìn)行三種不同病毒的捕獲與識(shí)別，通過對(duì)芯片不同位置進(jìn)行電鏡觀察，可以看到三種病毒都可以很好的在相應(yīng)區(qū)域被捕獲到。使用拉曼光譜對(duì)不同病毒進(jìn)行鑒定，可以清楚地區(qū)分三種病毒。使用機(jī)器學(xué)習(xí)的算法，實(shí)現(xiàn)了93 %的病毒識(shí)別。通過測序分析，三種病毒在測序數(shù)據(jù)中富集近10倍，并且病毒的基因覆蓋率得到大幅的提升。相比于傳統(tǒng)方法，該平臺(tái)可以在3分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)臨床樣本的病毒捕獲和識(shí)別。

圖5 臨床樣品中三種病毒的鑒定

[總結(jié)]

文章研究思路清晰，數(shù)據(jù)翔實(shí)，實(shí)際樣品驗(yàn)證完善。該文章沿用該組所擅長的碳納米管陣列，結(jié)合微流控技術(shù)，將其應(yīng)用在病毒檢測這一熱門領(lǐng)域，加之一些機(jī)器學(xué)習(xí)的內(nèi)容，使得文章比較豐滿。內(nèi)容具有一定開拓性和創(chuàng)新性。該文章沒有涉及如何解決病毒的釋放問題，只能通過整體回收的方法對(duì)富集的病毒基因組回收。這使得其分析結(jié)果只是一個(gè)整體性的分析。如果解決了這個(gè)問題，我們認(rèn)為還可以進(jìn)一步充分發(fā)揮可控的孔間隙所帶來的分區(qū)優(yōu)勢。病毒的富集和鑒定是傳染病研究領(lǐng)域的重要突破口，微流控技術(shù)的高通量、自動(dòng)化等優(yōu)勢，將給病毒分析領(lǐng)域帶來全新的應(yīng)用分析，我們期待更多的新技術(shù)被開發(fā)用于傳染病領(lǐng)域的檢測。

撰稿人：Lxer and Jienan Shen （李星銳，沈杰男）

編輯：面面

原文鏈接：

https://www.pnas.org/content/117/2/895.short 

部分參考文獻(xiàn)：

1.     Y.-T. Yeh et al., Tunable and label-free virus enrichment for ultrasensitive virus detection using carbon nanotube arrays. Sci. Adv. 2, e1601026 (2016)

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