循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC，Circulating Tumor Cell），即腫瘤在生長過程中，向血液循環(huán)中釋放的各類腫瘤細(xì)胞的總稱，是導(dǎo)致腫瘤擴(kuò)散的關(guān)鍵因素。

CTC從腫瘤病灶脫離后進(jìn)入外周血隨血液流動，沿著血流方向來尋找合適的“土壤”來生長，最后要么被毛細(xì)血管截留或者粘附在血管壁上，要么就在外周血中循環(huán)最后被清除，只有極少數(shù)目的 CTC能附著在血管壁上，重新穿過血管，到達(dá)新的“土壤”，適應(yīng)環(huán)境后成長為新的腫瘤。

CTC是一種生物標(biāo)志物（biomarker），這是目前臨床研發(fā)與應(yīng)用的重點，是被寄希望用于癌癥預(yù)后、分期診斷、療效監(jiān)控、復(fù)發(fā)預(yù)測、用藥指導(dǎo)、早期檢測等的標(biāo)志物。與經(jīng)典組織活檢相比，具有腫瘤分子信息全、侵入性小、取樣方便、成本低等優(yōu)勢。

CTC檢測的最大困難在于其在外周血中含量稀少，通常1 mL外周血中含有109個紅細(xì)胞，106個白細(xì)胞，而可能只含有1-10個CTC，在如此龐大復(fù)雜的正常細(xì)胞背景干擾下，比如巨核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，未成熟的造血細(xì)胞，上皮細(xì)胞等，很難實現(xiàn)高靈敏、高特異的CTC 捕獲檢測。

盡管目前市場有各種各樣用于分離及檢測CTC技術(shù)，但由于缺乏必要的敏感性，它們的臨床應(yīng)用并不被廣泛采用，大多數(shù)技術(shù)往往受到捕捉性的限制，在捕獲的高效率與高純度之間難以進(jìn)行權(quán)衡?，F(xiàn)在已經(jīng)使用的微型柱和人字形結(jié)構(gòu)成功的證明可以增加細(xì)胞和免疫表面相互作用，提高捕獲效率，可遺憾的是，這種增強的相互作用是非選擇性的，與非靶細(xì)胞相互作用的均等性機(jī)會將導(dǎo)致最后捕獲的CTC純度并不是很高。

研究者開發(fā)的基于流體力學(xué)分離與免疫識別的CTC捕獲富集芯片（SDI-Chip）技術(shù)，其內(nèi)構(gòu)建了成千上萬個表面修飾有抗體的微柱陣列，微柱陣列排布方式根據(jù)確定性側(cè)向位移分離原理設(shè)計，CTC因尺寸較大將沿微柱偏移方向運動并不斷與微柱碰撞而實現(xiàn)特異性識別捕獲，而血細(xì)胞因尺寸較小將沿液流方向運動且很少與微柱碰撞而避免非特異性吸附。該設(shè)計有效地結(jié)合CTC在物理性質(zhì)及表面標(biāo)志物與背景細(xì)胞的差異，實現(xiàn)了CTC的高效、高純度協(xié)同捕獲。通過對大量臨床腫瘤病人外周血樣品的測試，該研究者驗證了所發(fā)展的芯片技術(shù)在腫瘤分期診斷、療效監(jiān)控等方面的潛在應(yīng)用價值。

SDI-Chip由兩個鏡像一樣的包被上皮細(xì)胞粘附分子抗體（EpCAM）的微柱陣列組成，中間有一個樣品入口，并有上下兩個緩沖區(qū)入口（圖1）。

通過計算流體動力學(xué)（CFD）用于對不同幾何形狀進(jìn)行排序，并進(jìn)一步優(yōu)化微柱的布置，與圓形和橢圓形微柱相比，三角形微柱提供更高的相互作用概率和較低的剪切應(yīng)力（圖2）。

為了可視化流動模式和細(xì)胞與微柱的相互作用，研究者開發(fā)了一個模擬將CFD與固體力學(xué)相結(jié)合的模型，將不同尺寸的球形顆通過路上的微柱，然后粒泵送到出口，見圖3

大于臨界直徑（Dc，13μm）的顆粒在與之相互作用的過程中被迫偏轉(zhuǎn)離并交叉流線于微柱。由于每一列微柱被安排的與上一行偏離，大顆粒不斷與每一個微柱相互作用，導(dǎo)致流動形成了偏斜角。相比之下，小于Dc的粒子仍然以原始流線運行，并減少與微柱的相互作用。模擬結(jié)果使用聚苯乙烯（PS）珠證實了實驗觀察到相同的流動模式。

總體而言，發(fā)現(xiàn)了20μm微粒的相互作用概率大于95％，10um微粒相比有顯著提高，相互作用僅有5.5％。結(jié)果證明，SDI-Chip可以選擇性地增強大顆粒與微柱相互作用。由于CTC的大小通常大于血細(xì)胞，這樣的大小選擇性相互作用可以高效率和高純度的免疫捕獲CTC。

圖5E.以順時針旋轉(zhuǎn)一個三角形的微柱，到15o在它的軸線周圍提供了一個更光滑的水動力梯度不影響細(xì)胞流動模式的力量。

圖5F. 由于流體的影響，水動力的梯度下降與旋轉(zhuǎn)的三角形微柱的斜坡相互作用產(chǎn)生增加了粘附力的梯度。因此，每個相互作用，ctc遷移到一個水動力區(qū)域減小梯度，致使流速減小，導(dǎo)致與免疫組織微量柱接觸的持續(xù)時間延長。

圖6. 在微柱旋轉(zhuǎn)過程中剪切應(yīng)力和在三角形微柱表面捕獲的細(xì)胞分布

SDI – Chip進(jìn)行了傳統(tǒng)軟光刻技術(shù)優(yōu)化，后表面改性，抗體固定化和濃度優(yōu)化，捕獲芯片的性能驗證使用了EpCAM-陽性SW480懸浮液細(xì)胞作為靶細(xì)胞（1000細(xì)胞/ml），293T細(xì)胞（EpCAM-陰性/罕見表達(dá)EpCAM）的懸浮液細(xì)胞和白細(xì)胞（WBCs）（106細(xì)胞/ml）作為對照細(xì)胞，通過50μm的最佳通道深度和流量為1ml/h的設(shè)備進(jìn)行檢測。

圖7. (A)表面化學(xué)改性和EpCAM抗體固定過程的示意圖。(B)顯微照相熒光標(biāo)記靶(SW480)細(xì)胞在緩沖或血液中分散，對照細(xì)胞(293T和WBCs)與免疫球蛋白SDI-Chip的結(jié)合。(C)和(D)顯微攝影顯示熒光標(biāo)記SW480細(xì)胞的近視野。

通過在Buffer中摻入SW480細(xì)胞，SDI– Chip的捕獲效率為99.2±3.5％，純度為92.4±4.6％（圖8C），同時研究者也展示了SDI芯片的臨床潛力，使用血液樣品進(jìn)行細(xì)胞的捕獲實驗，通過將1000個SW480細(xì)胞加入1mL健康血液中來制備供體的血液。平均捕獲效率和純度分別為92.2±6.4％和82.3±3.8％（圖8D）。如此高的捕獲效率和純度是歸因于基于DLD原理的免疫接種相互作用。此外，具有由旋轉(zhuǎn)提供的流體動力的梯度，在微柱表面上延長接觸時間，三角形微柱也被認(rèn)為有助于提高捕獲效率。此外，靶細(xì)胞等血液細(xì)胞流向芯片的空間不同的區(qū)域，這可以減少目標(biāo)細(xì)胞的競爭性脫落并確保在高細(xì)胞背景下存在高捕獲效率。

剪切力的流體動力學(xué)梯度圍繞旋轉(zhuǎn)的三角形微柱產(chǎn)生（圖9A）允許根據(jù)其抗原來描述捕獲CTC微柱周圍的表達(dá)水平。細(xì)胞表達(dá)較高表面抗原量的CTC形成較強可以抵抗由于剪切而產(chǎn)生的移動力的結(jié)合，并且被捕獲在三角形微柱的頂端附近。另一方面，表達(dá)細(xì)胞表面抗原相對較少量的CTC不會形成足夠強的抵抗力脫落力，因此，他們將沿著斜坡向下移動（較低的剪切應(yīng)力面積），直到它們形成足夠牢固的粘結(jié)以抵抗該地區(qū)的流體動力。

捕獲的SW480細(xì)胞使用微透鏡觀察使用熒光標(biāo)記的EpCAM抗體染色的CTC，來評價EpCAM表達(dá)水平熒光強度（圖9B）。與低細(xì)胞的熒光強度相比，熒光強度較高的細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)被捕獲在剪切應(yīng)力的區(qū)域相對較高。這樣的空間解決捕獲使我們能夠評估在芯片中捕獲的CTC的抗原表達(dá)水平，通過觀察CTC圍繞微柱的捕獲位置及抗原進(jìn)行其他下游分析。

在SDI- Chip的免疫染色后，采集CTC和白細(xì)胞的樣品顯微圖（圖10）：

用EpCAM、CK、CD45抗體、DAPI對SDI- Chip進(jìn)行免疫染色后，采集CTC集群的樣品顯微攝影（圖11）：

國內(nèi)液體活檢產(chǎn)業(yè)正在如火如荼的蓬勃發(fā)展，各種技術(shù)都在日新月異的變化，無疑會帶來更多市場格局的變化，從研究到臨床轉(zhuǎn)化研究再到臨床應(yīng)用，是一個漫長而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牡缆?，希?/span>CTC技術(shù)能夠早日成熟，造福于更多的腫瘤患者！

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