作為液體活檢的重要標(biāo)志物之一,循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)在外周血中的含量可以用來輔助判斷患者的癌癥病發(fā)狀況。除此以外,CTCs對于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為等基礎(chǔ)研究也具有非常重要的意義。然而人體血液中的CTCs含量極其稀少,通常僅有0~10個/mL,與之相對,紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的含量則分別達到5×109 個/mL、4×106 個/mL和3×108 個/mL,而且腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中可以通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)來不斷地改變自身的特征。正是由于其稀缺性和異質(zhì)性,以及血液中復(fù)雜基質(zhì)的干擾,CTCs的精準(zhǔn)檢測成為巨大的難題。

由于常規(guī)的光學(xué)分析手段在檢出限和靈敏度上均難以達到直接檢測的要求,因此通常在進行外周血中CTCs的檢測之前,要通過一些樣品前處理方法來實現(xiàn)其分離和富集。常采用的樣品前處理方法可以分為物理法和化學(xué)法,物理法主要根據(jù)細(xì)胞在物理特征上的差異來進行分離,例如膜過濾分離和密度梯度離心,就是分別依據(jù)細(xì)胞的大小和密度來完成篩選。化學(xué)法則主要依靠生物大分子的特異性識別作用,例如抗原抗體相互作用,核酸適配體與靶標(biāo)的選擇性結(jié)合。

上述樣品前處理方法雖然能夠在不同程度上實現(xiàn)CTCs的分離富集,但也存在著一定的缺陷。由于這些方法都是非連續(xù)性的,在吸附、洗脫和轉(zhuǎn)移的過程中難免會造成細(xì)胞的丟失,加之CTCs本身的稀缺性,很容易導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。利用微流控芯片功能集成的特點則可以很好地解決這一問題,CTCs的捕獲、釋放、計數(shù)及檢測等操作均可在芯片上完成,連續(xù)的自動化處理可以有效減少人為誤差的干擾。此外,微流控芯片所需要的進樣量非常小,可以大大減少珍貴樣品和試劑的消耗,降低檢測成本。并且在微尺度下表面力的作用會明顯放大,可以有效提高物質(zhì)混合和反應(yīng)的效率,實現(xiàn)快速高效的分離分析。因此,近年來多項研究嘗試?yán)梦⒘骺匦酒脚_開展CTCs分離檢測工作,取得了良好的效果。本文對微流控芯片技術(shù)用于CTCs分離檢測的相關(guān)研究進展進行了綜述,將采用的分離方法主要分為物理篩選和生物親和兩大類,同時囊括正向富集和反向富集兩種策略。此外,對于近期發(fā)展的芯片原位檢測CTCs新方法也進行了介紹。

1、CTCs分離芯片研究進展

作為商品化較為成功的CTCs分離檢測系統(tǒng),強生公司的CellSearch產(chǎn)品采用的是基于上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)抗體特異性識別腫瘤細(xì)胞的方法,類似的方法在CTCs分離芯片中也被廣泛使用,可以視作利用生物親和作用進行CTCs分離富集的代表。

另一方面,依據(jù)細(xì)胞在物理性質(zhì)方面的差異,無須生物標(biāo)志物的條件下即可實現(xiàn)CTCs的篩選,其中有無外力介入的被動分離方法,例如利用微尺度下流體力學(xué)中的慣性效應(yīng)和黏彈性效應(yīng)來進行篩分。

也有外加物理場的主動分離方法,諸如介電泳、表面聲波和光鑷技術(shù)等。除了直接對CTCs進行特異性識別實現(xiàn)正向富集外,也可以通過選擇性結(jié)合諸如白細(xì)胞等干擾,再將其排除,從而達到反向富集的效果。

2、芯片原位CTCs檢測

對于CTCs的檢測,通常采取先進行細(xì)胞染色,再用熒光顯微鏡觀察的方法,但該方法在靈敏度上有待提高,且重現(xiàn)性較差,需要手動操作和人工計數(shù)。

此外,以熒光光譜為代表,一些常見的光譜檢測手段也被廣泛應(yīng)用在芯片上CTCs的檢測中。

除了光學(xué)分析方法外,研究人員通過使用傳感元件實現(xiàn)了CTCs芯片檢測結(jié)果的數(shù)字化直讀或可視化分析。

3、總結(jié)與展望

本文對CTCs分離微流控芯片的技術(shù)原理、分離策略和研究進展進行了綜述。其技術(shù)原理主要分為物理篩選和生物親和兩大類,分離策略分為正向富集和反向富集兩個方向。同時,介紹了CTCs芯片原位檢測的主要技術(shù)方法和優(yōu)化策略。隨著微流控芯片技術(shù)的快速發(fā)展,其微尺度流體操控、微結(jié)構(gòu)加工和集成傳感檢測能力得到極大提升,進一步推動了CTCs分離微流控芯片技術(shù)的發(fā)展。多項研究顯示,以微流控芯片為平臺來分離檢測外周血中的CTCs,可以充分發(fā)揮芯片本身微量、高效、易于自動化和集成化的優(yōu)勢,最終實現(xiàn)對臨床血液中CTCs的快速精準(zhǔn)分析,在腫瘤早期診斷、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移監(jiān)測以及抗腫瘤藥物評價等多個領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用空間。

現(xiàn)階段,CTCs芯片在篩選精度和篩選效率方面仍存在較大的提升空間。針對這一挑戰(zhàn),由于精準(zhǔn)與高效二者難以兼得,未來的芯片設(shè)計應(yīng)該更專注于單個目標(biāo)的實現(xiàn)。一方面,針對基礎(chǔ)研究,應(yīng)當(dāng)注重于提高CTCs篩選的細(xì)胞純度及細(xì)胞活性。可以先利用慣性效應(yīng)對血液進行粗分離,篩分出尺寸較大的白細(xì)胞和CTCs。再采用液滴分選的方法,通過免疫磁性分離實現(xiàn)CTCs的精確篩選。液滴分選技術(shù)能夠達到單細(xì)胞分析的精度,利用液滴分選進行腫瘤細(xì)胞篩選也已有文獻報道。另一方面,針對臨床檢測領(lǐng)域,研究重點則在于實現(xiàn)臨床樣本的高通量分析。可以采用電分析方法,依據(jù)不同種類細(xì)胞的比膜電容和細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率差異來設(shè)置恰當(dāng)?shù)拈撝?對流經(jīng)檢測窗口的CTCs實現(xiàn)快速分析。此外,微流控芯片技術(shù)屬于多學(xué)科交叉領(lǐng)域,CTCs芯片的發(fā)展同時也受益于微機電系統(tǒng)(MEMS)、材料學(xué)、流體力學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域的技術(shù)突破。隨著相關(guān)領(lǐng)域研究技術(shù)的發(fā)展,CTCs芯片未來有望成為腫瘤基礎(chǔ)研究和癌癥早期臨床診斷的重要平臺。

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