單細胞測序已逐漸成為科研熱點，它解決了用組織樣本測序或樣本少時無法解決的細胞異質(zhì)性難題，為科學(xué)家研究解析單個細胞的行為、機制、與機體的關(guān)系等提供了新方向。但是單細胞測序遇到的第一個難題就是：“如何獲取單細胞？”

1.有限稀釋法（Limiting Dilution）

有限稀釋法是根據(jù)細胞懸液濃度的計算，逐步稀釋得到一定體積內(nèi)只有1個或少量細胞的方法（一般為1 ul，多數(shù)WGA/WTA試劑盒可容納投入體積）。

該方法操作簡單，無需特殊設(shè)備。但是，由于分選基于濃度計算，無法直接觀察，容易出現(xiàn)錯誤。

2.顯微操作法（Micromanipulator）

顯微操作法是將細胞懸液置于顯微鏡下進行單細胞挑選的方法，細胞挑選過程更直觀。低配版顯微操作，可以使用口吸管（英文名：Aspirator tube assembly）來進行；如果有經(jīng)濟實力的客戶，可以使用顯微操作臺進行操作。首先，需要將細胞懸液進行稀釋，濃度在20個細胞每微升為宜。吸取細胞時，毛細管內(nèi)不能有太多的緩沖液，保證毛細管內(nèi)液體在1ul左右。然后將毛細管內(nèi)液體吹入反應(yīng)管中，反應(yīng)管中預(yù)先加入的4 ul裂解液，這一過程切忌產(chǎn)生氣泡。

顯微操作的優(yōu)勢在于能夠準確地控制單細胞的吸取與釋放；其缺點在于通量低，對操作人員的技術(shù)要求高。

3.熒光流式分選（FACS）

熒光流式分選能夠很好的實現(xiàn)大量細胞的分選過程，并且能夠做到精度高、通量大。但是它要求的細胞數(shù)量多，需要的樣本初始體積較大，使一些小體積或微量樣本 ( 如細針穿刺液 ) 分離單細胞受到了制約。該方法需要配備具有分選功能的流式細胞儀。在進行流式分選的過程中，需要先將樣本制成細胞懸液。不同形式的樣品，制作細胞懸液的方法也有所不同。

我們最為常見的樣本類型有：新鮮實體組織、外周血單核細胞（PBMC）及培養(yǎng)細胞等。其中，新鮮實體組織需要經(jīng)過酶解法、機械法或者化學(xué)處理法等方法進行細胞分散，制作細胞懸液。在制作細胞懸液的過程中需要注意：①無菌操作；②操作過程要迅速；③染色和固定避免對細胞產(chǎn)生傷害；④在分選前進行細胞計數(shù)和活性統(tǒng)計。

4.微流控技術(shù)（Microfluidics）

微流控技術(shù)可利用重力離心、流體力學(xué)、電場力等來捕獲細胞，也可以通過流體力學(xué)利用細胞大小、細胞表面標志物等進行分選，同時可以整合細胞培養(yǎng)、細胞捕獲分選、細胞裂解及后續(xù)的檢測分析基于一體。可直觀辨別目的細胞、實現(xiàn)高通量單細胞分離、自動化集成化。

5.激光顯微切割技術(shù)（LCM）

對于切片組織樣本，我們需要用到激光顯微切割技術(shù)。該方法可直接觀察分離樣本，避免分離偏差；可以通過細胞形態(tài)觀察，分離稀有細胞；同時可以了解到細胞的位置信息。但是，該方法也存在著分離通量低的缺陷，而且分離的過程中可能會破壞細胞的完整性。

在進行該方法的細胞分離時需要注意：①需要選擇合適的細胞染料，避免染色過程中的RNA降解；②切片制作及細胞切割操作要盡量迅速；③分選下來的細胞附著在膜片上，可先將膜片上的核酸收集于大體積體系后再濃縮。

總之，細胞分選的方法多種多樣。我們需要根據(jù)實驗材料的特點、樣本的細胞數(shù)量以及實驗的設(shè)計思路等因素綜合考慮，選擇最合適的單細胞分選方法。